01.实验原理益牛网
萤光素酶互补实验（LCA）是在BiFC基础上发展出来的一种研究蛋白互作的技术，将萤光素酶切成N端和C端两个功能片段，并分别与待检测的目标蛋白融合。如果两个目标蛋白有相互作用，则N端片段和C端片段在空间上靠近并互补，从而发挥萤光素酶活性，催化底物产生光。
市面上很多家公司对这个实验的命名有所不同，比如下面三个缩写虽然看着名字不同，但其实都是指的荧光素酶互补实验。
简称
英文全称
LCA
Luciferase Complementation Assay
Split-LUC
展开剩余90%Split Luciferase
LCI
luciferase complementation imaging
02.实验优缺点
❖实时监测：由于荧光素酶催化反应迅速，且生物发光信号强，LCA能够实现实时监测蛋白质互作，无需固定或裂解细胞，从而减少了样品处理过程中的损失和变异。
❖非侵入性检测：LCA在活细胞内进行，不会破坏细胞结构，允许在生理条件下观察蛋白质互作益牛网，提供更真实的生物学环境下的互作信息。
❖动态范围宽：LCA能够覆盖广泛的互作强度，从弱到强的互作均可检测。
❖缺点：假阳性比较高，需要其它的蛋白互作方法进行进一步的验证
03.核心步骤
❖构建融合蛋白：
A基因序列构建到pCAMBIA1300-CLuc载体上测序验证；
B基因序列构建到pCAMBIA1300-NLuc载体上测序验证。
❖烟草转化：
将上述重组质粒转化大肠杆菌扩繁后转化农杆菌，选取生长状态良好的幼嫩烟草叶片，进行农杆菌注射，培养。
❖定性观察：
植物荧光成像仪观察发光强度并拍照记录表型
04.结果解读
图1.金开瑞LCA实验结果图
1、如左图所示，通常将质粒组合分为四组益牛网，分别注射到烟草叶片的四个区域；
2、“A-nLUC”指A蛋白与LUC的n端片段相连，“B-cLUC”指B蛋白与LUC的c端片段相连，“nLUC”和“cLUC”指仅包含LUC的n端片段或c端片段的空载；
3、如图所示，左上角为实验组，若蛋白A与B能够互作，则LUC的n端片段和c端片段也可以互相接近结合，恢复酶活性，从而酶解底物发出荧光；
4、其余3组均为阴性对照组，正常情况下不会检测到荧光。
05.文献分享
现在发表的文章一般都是通过几种实验共同验证分子互作关系，接下来通过文献来看看LCA在蛋白互作探究中的应用：
文献1：
发表在中科院一区期刊 Horticulture Research 上的一篇题为“CsNAC17 enhances resistance to Colletotrichum gloeosporioides by interacting with CsbHLH62 in Camellia sinensis ”的文章，揭示了CsbHLH62与CsNAC17互作调控茶树炭疽病抗性，为抗病茶树种质创制提供了理论依据。
作者先用使用Y2H 测定研究 CsNAC17 耐药机制，结果证实了酵母细胞中 CsNAC17 和 CsbHLH62 之间的特异性相互作用，然后在烟草叶中进行免疫共沉淀实验和BIFC实验，进一步验证了 CsNAC17 和 CsbHLH62 之间的相互作用。最后使用荧光素酶互补实验（LCA）显示，共转化 48 小时后，成像结果显示 nLUC-CsNAC17 和 cLUC-CsbHLH62 的组合具有独特的荧光信号（图d），支持 CsNAC17 和 CsbHLH62 之间的相互作用。
图2. CsNAC17 和 CsbHLH62 的相互作用分析。（A）Y2H 测定显示酵母细胞中 CsNAC17 和 CsbHLH62 之间的相互作用。（B）Co-IP （C）双分子荧光互补 （D） 显示 CsNAC17 和 CsbHLH62 之间相互作用的分裂 LUC 测定。控件为：nLUC + cLUC; nLUC-CsNAC17 + cLUC; nLUC + cLUC- CsbHLH62，发光强度显示烟草中 CsNAC17 和 CsbHLH62 的相互作用。
文献2：
2025年3月发表在《Nature communications》期刊上的一篇研究性论文，作者发现盐胁迫显著诱导 Mediator cyclin 依赖性激酶 8 （CDK8） 的激酶活性，这对于其在调节耐盐性中的积极作用至关重要。CDK8 经鉴定可在丝氨酸 314 位点磷酸化 AT 钩基序核定位蛋白 10 （AHL10），导致其在盐胁迫下降解。而且还发现 AHL10 负向调节耐盐性。
为了探究CDK8的分子机制，作者利用磷酸化组学实验去探究CDK8的底物，并且在拟南芥中鉴定到97 个CDK8的底物，选取AHL10进行研究，之后作者利用酵母双杂一对一、BiFC、Co-IP和split-luc发现CDK8和AHL10确实可以发生互作。最后，作者为了探究盐胁迫是否会影响CDK8和AHL10的相互作用，利用CDK8-MYC和AHL10- GFP进行Co-IP实验，发现盐胁迫后，其相互作用显著增强。
图3.CDK8 与 AHL10 物理相互作用。a: Y2H 测定显示 CDK8 与 AHL10 的物理相互作用。b: CDK8 在 BiFC 测定中与 AHL10 相互作用。MED18 用作阴性对照。比例尺 = 50 μm。c: Co-IP 测定证实体内 CDK8-AHL10 相互作用。单独表达 CDK8-MYC 和 AHL10-GFP 的转基因是阴性对照。d: LCI 测定显示烟叶中 CDK8 和 AHL10 之间的相互作用。MED18 用作阴性对照。CYCCb 用作阳性对照。免疫印迹证实了 nLUC 和 cLUC 融合的蛋白表达，如用抗荧光素酶和抗 cLUC 抗体测定的那样。e: Co-IP 测定证实，盐应激导致体内 CDK8-AHL10 相互作用增强。单独表达 CDK8-MYC 的转基因是阴性对照。进行了两个独立的实验，结果相似。
文献3：
今年五月在国际知名期刊《Plant Biotechnology Journal》上发表的一片题为“A natural variation in the promoter of TaGDSL-7D contributes to grain weight and yield in wheat”的研究论文。
该研究利用图位克隆等技术，深度解析了小麦 TaGDSL-7D 基因启动子变异对小麦粒重及产量的影响，揭示了 TaGDSL-7D 基因通过与转录因子 TaGT1 及激素信号组分 TaBZR1 相互作用调控小麦粒重的新机制。
为了确认植物中 TaGT1 和 TaBZR1 之间的相互作用，首先进行了分裂 LUC 互补测定 （图 4a）。将 TaGT1 融合到 LUC 的 N 端以产生 TaGT1-nLUC，并将 TaBZR1 连接到 LUC 的 C 端以产生 cLUC-TaBZR1。将这些构建体共同转化到本氏烟草叶子导致了显著的 LUC 活性。相比之下，阴性对照显示无活性，表明 TaGT1 在体内与 TaBZR1 相关。此外，又通过GST-pull down和共免疫沉淀（CoIP）实验，证明了 TaGT1 和 TaBZR1 在调节 TaGDSL-7D 表达中存在功能相互作用。
图4. TaGT1 与 TaBZR1 相互作用以协调激活 TaGDSL-7D 表达。（a-c）TaGT1 与 TaBZR1 的相互作用分别通过 LCI （a） 、 Pull-down （b）和 Co-IP（c）证实。进行了三个独立的实验。
荧光素酶互补技术（LCA）凭借其操作相对简便、灵敏度高、可实时活体监测等显著优势，已成为揭示蛋白质间相互作用动态过程的一把利器。从基础分子机制研究到药物靶点筛选验证，从植物信号通路解析到病原体-宿主互作探究，LCA的应用正不断拓展着我们对生命活动复杂网络的理解边界。尽管存在假阳性/假阴性、定量精确性等挑战，其非破坏性、直观发光报告的核心特点使其在众多蛋白质互作检测方法中占据独特地位。
金开瑞能够提供包括荧光素酶蛋白互补实验（LCA）、双分子荧光互补（BIFC）、免疫共沉淀（Co-IP）、酵母杂交（YIH/Y2H）、GST pull-down、ChIP、EMSA和双荧光素酶报告基因等在内的十余种前沿互作技术服务，期待与您携手同行，共同推动生命科学的发展。
参考文献：
[1] Han R, Mei H, Huang Q, Ma C, Zhao Y, Jeyaraj A, Zhuang J, Wang Y, Chen X, Liu S, Li X. CsNAC17 enhances resistance to Colletotrichum gloeosporioides by interacting with CsbHLH62 in Camellia sinensis. Hortic Res. 2024 Oct 14;12(2):uhae295.
[2]Guo P, Chong L, Jiao Z, Xu R, Niu Q, Zhu Y. Salt stress activates the CDK8-AHL10-SUVH2/9 module to dynamically regulate salt tolerance in Arabidopsis. Nat Commun. 2025 Mar 12;16(1):2454.
[3]He F益牛网, Du D, Chen Z, Ma L, Liu Y, Li Z, Song L, Jiang Z, Fan Y, Sun Q, Ni Z. A natural variation in the promoter of TaGDSL-7D contributes to grain weight and yield in wheat. Plant Biotechnol J. 2025 Jun 16.
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